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问与答
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Question:

关于二代测序(NGS)的产品,如果要更换不同品牌的建库试剂盒,这种验证要做到什么程度?只选几个标准品用新的试剂盒做一遍实验出结果可以吗?还是要从input,重复性等方面都要做一遍呢?

Answer:

关于二代测序更换不同品牌的建库试剂盒后的验证,没有明确的说法,要靠技术部门去鉴定,具体问题具体分析。
根据CAP的要求(MOL.36015 CAP Molecular Pathology Checklist),Major change 需要进行全面的方法学性能验证,如:更换了例如测序平台(sequencing platform)、富集方法(target enrichment method)、探针等。而Minor Change可以做部分验证,如:更换了试剂盒的批号等。
具体针对建库试剂盒变更,可能涉及到不同程度的检测原理、方法或试剂盒内容物等的变化,需要各个实验室的科学家和主任来定义minor和major,综合评估决定是做一次全面的方法学性能确认还是用样本和标准品做一个简单的变更确认和比对实验。
比如说本来用的KAPA试剂盒建库现在为了节约成本用上了ABclonal,从二者的应用和原理上来说比较类似,经过评估之后也可以定义为minor change做部分验证,评价新旧试剂之间的建库情况:从抽提开始,除了建库其他条件都一致,做5-10个样本(覆盖不同的突变类型和目标突变)的新旧试剂比对。验证前制定需要评估的指标参数(比如建库得率、最终的on target、AF等)和评估标准。如果结果不佳,则需要扩大研究,如果结果均在可控范围,则可以在未来使用中持续观察。

另外,只用标准品做新试剂盒验证是不够的,至少要加一些用原来的建库试剂盒检测过的样本,样本数量、重复次数和验收合格指标还是要由技术负责人决定,而且NGS检测一定记得要经过干实验分析端的评估,因为湿实验端条件改变对结果分析的影响很多都是未知的,不建议只做建库这一个环节的比对验证。